Piezoelectric Genosensor

Escherichia coli O157:H7 es un patógeno importante en la contaminación de alimentos que causa brotes con una alta morbilidad. Dado que los métodos tradicionales para su detección, a menudo tardan 24 horas en emitir el resultado, existe la necesidad de desarrollar nuevas metodologías que permitan una detección rápida, simple, confiable y específica. Bajo este escenario, el desarrollo de biosensores puede ser una alternativa para dar un resultado rápido cuando exista sospecha de contaminación. Un genosensor piezoeléctrico es un dispositivo capaz de modificar la frecuencia de vibración del cristal de cuarzo, debido a los cambios de masa producidos en la superficie del electrodo de oro, estos son el resultado de la interacción entre el biomarcador de interés y el biorreceptor génico que se encuentra inmovilizado a la superficie del transductor por medio de la interfaz biológica. El adecuado diseño y selección de los elementos específicos de reconocimiento biológico, la apropiada inmovilización sobre el transductor y la selección y desarrollo del sistema de caracterización, se convierten en tareas fundamentales para el éxito en el desarrollo de estos dispositivos de detección. En esta investigación, se seleccionó como biomarcador del patógeno, una región del gen rfbE, que codifica para el antígeno O de la bacteria. Aplicando el método de fisiadsorción basado en la unión entre la proteína estreptavidina y la molécula biotina, se inmovilizó el biorreceptor génico sobre la superficie, para detectar la hibridación de este con su secuencia complementaria. Para la detección del evento biológico de interés, se utilizó un genosensor piezoeléctrico, configurado como microbalanza de cristal de cuarzo de alta frecuencia. Finalmente, se analizó el desempeño del dispositivo por medio de las características de especificidad, repetibilidad y reusabilidad.Escherichia coli O157: H7 is a major pathogen in food contamination that causes outbreaks with high morbidity. The traditional methods for their detection often take a long time, therefore there is a need to develop new methodologies that allow rapid, simple, reliable and specific detection. Under this scenario, development in biosensors could offer an alternative for fast testing in suspected cases of bacterial contamination. A piezoelectric genosensor is a device that is able to shift its quartz crystal frequency give mass changed on the surface of its gold electrode, which occur due to the interaction between the biomarker and the gene bioreceptor, which is immobilized on the transducer surface through biological interface. The appropriate design and selection of the specific elements for biological recognition, adequate immobilization on the transducer and the selection and development of the characterization system, are essential tasks for successfully develop these devices. In this research, it was selected a sequence of the rfbE gene as a biomarker, which encodes O-antigen in Escherichia coli. Applying the physisorption method based on the union between the streptavidin protein and the biotin molecule, the bioreceptor was immobilized on the surface for the detection of the complementary strand. The piezoelectric genosensor was configured to be a high-frequency quartz crystal microbalance. Finally, the performance of the device was analyzed assessing specificity, repeatability, and reusability characteristicsDesarrollo de un genosensor piezoeléctrico para la detección de secuencias de ADN de patógenos infecciososMaestrí

Inmovilización de sondas de ADN como bioreceptor de un genosensor piezoeléctrico y su evaluación mediante técnicas de caracterización para superficies

58 páginasLa detección de ADN como metodología de diagnóstico en pacientes y de evaluación de indicadores de calidad de productos o condiciones ambientales, ha surgido como una alternativa de interés en los últimos años, esto por sus muchas ventajas como rapidez, múltiples aplicaciones y sencillez de los ensayos. Los biosensores son un ejemplo de tecnología novedosa para detección de ADN, una tecnología rápida, sencilla y precisa que permiten la detección de diferentes moléculas y por diferentes sistemas de transducción, variables que los distribuyen en diferentes categorías. Por esto, un biosensor que detecte la hibridación de cadenas complementarias de ADN, se llama un genosensor y si este utiliza los cambios de frecuencia por alteraciones másicas en cristales piezoeléctricos o micro balanzas de cuarzo como sistema de transducción, entonces se clasifica como un genosensor piezoeléctrico. Una de las partes más importantes de estos genosensores es la superficie, dado que allí es donde se encontrarán las moléculas inmovilizadas, entre ellas el bioreceptor, de las cuales dependerán las señalas producidas y que podrán ser analizadas. La caracterización de estas superficies por medio de diferentes metodologías, posee entonces una importancia alta para el mejor entendimiento, optimización y resultados de estas tecnologías. En el presente trabajo se realizó una revisión bibliográfica de las diferentes metodologías de caracterización de superficies metálicas y que estuvieran disponibles, para el conocimiento de su funcionamiento y potencial aplicación para caracterización de superficies inmovilizadas con ADN. También se inmovilizaron sondas de ADN de cadena sencilla sobre electrodos de oro de cristales de cuarzo de 10 MHz. Para este proceso se comenzó con la conjugación química del ADN y su posterior separación por precipitación, etapa necesaria para formar un enlace fosforamidita que permita la inmovilización de la sonda. La metodología aplicada en el proceso de inmovilización de sondas de ADN fue la formación de monocapas autoensambladas mixtas (MSAM), inmovilizando diferentes concentraciones de ADN en solución: 40, 20, 10, 7.5, 5, 2.5, 1.2, 0.625, 0.3125, 0.15625 y 0.02604 µM. Estas superficies funcionalizadas fueron caracterizadas por medio de Espectroscopia infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR), se analizaron las bandas de interés (SAM, activación y ADN) y se realizó una curva de calibración, la cual tuvo un coeficiente de correlación R2=0,98989 y presentó limites inferiores y superiores de 40 y 0.02604 uM respectivamente.PregradoIngeniero(a) Biomédico(a

Propuesta de un genosensor electroquímico para el diagnóstico del SARS-CoV 2

En el presente Trabajo de Fin de Grado se presenta una revisión bibliográfica de la pandemia mundial de 2020 que dio comienzo a finales de 2019 en China, originada por el SARS-CoV-2. Es un virus comúnmente conocido como coronavirus, pertenece a una de las dos subfamilias de la familia Coronaviridae y afecta al sistema respiratorio del ser humano. En este trabajo se exponen dos tipos de diagnóstico basados en un inmunosensor piezoeléctrico y un genosensor electroquímico, además de los métodos rutinarios empleados en el momento de mayor número de contagios. Así mismo, se propone el diagnóstico mediante un hipotético biosensor que reúne las mejores características de los ensayos citados, tratando de corregir sus deficiencias. El diagnóstico propuesto podría mejorar el tiempo de análisis siendo de gran ayuda para reducir el número de contagios

Desarrollo de métodos integrados para la determinación de biomarcadores genéticos

Tesis por compendio[EN] The selective and sensitive detection of single nucleotide variations is essential for early diagnosis, individualized therapy, and disease prognosis. The SARS-CoV-2 pandemic has highlighted the pressing need to develop reliable, rapid and simple detection methods for mass diagnosis. Likewise, there is a growing demand for genomic biosensors that are selective, multi-analyte and low-cost and allow the detection and identification of certain oncological biomarkers. This doctoral thesis has focused on the development of integrated systems of isothermal amplification, selective hybridization and optical biosensing for detection of point mutations in the PIK3CA, KRAS and BRAF genes associated with colorectal cancer. These predictive biomarkers are related to increased cell proliferation, apoptosis, and resistance to monoclonal antibody treatments (Cetuximab and Panitumumab). Isothermal DNA amplification methods have been explored, as they are particularly suitable for the development of a new generation of diagnostic devices aimed at supporting precision medicine. Specifically, isothermal amplification by recombinase-polymerase (RPA) has been selected as an alternative to detection methods that require unique infrastructures. In addition, its integration with bioanalytical platforms has been investigated, which represents a great advance for the simplification of biorecognition processes and their optical detection. This methodology has presented advantages over other DNA detection systems, in terms of portability and equipment, as well as reduction of test times and the possibility of performing diagnostic tests outside the laboratory. This doctoral thesis, framed in this context, is structured in 4 chapters: In chapter 1 a new variant of recombinase-polymerase amplification is presented, called RPA-blocked, based on the enrichment of minority alleles by introducing a blocking agent. In addition, this research has developed an analytical support consisting of a polycarbonate chip with covalently anchored allele-specific probes.The integration of the method has allowed the development of a portable system for the simultaneous genotyping of mutations in exons 9 and 20 of the PIK3CA gene. in cell lines and tumor tissues of cancer patients. In Chapter 2, the development of a genosensor that incorporates magnetic particles conjugated to allele-specific probes for the concentration and detection of the selective amplification product derived from RPA-blocked is described. With this genosensor, hybridization times and reaction volumes have been reduced. This approach has resulted in a portable and low-cost system for genotyping the KRAS gene applicable to solid tumor samples. Chapters 3 and 4 focus on the development of thermoplastic surfaces for the covalent anchoring of allele-specific probes mediated by dendrimeric molecules, with the aim of increasing the immobilization density. Thus, the covalent anchoring to activated polycarbonate and cycloolefin thermoplastic surfaces of allele-specific probes has been studied, mediated by carboxylic dendrimers through carbodiimide chemistry and by dendrons through the chemoselective reaction of the thiol-ino group. These multiplexed genosensors have allowed the genotyping of the V600 codon of the BRAF gene and the H1047 codon of the PIK3CA gene, in biopsied tissue samples. The research carried out in this thesis has given rise to new methodological contributions of interest based on obtaining integrated biosensor systems. These platforms will contribute to the development of massive diagnostic tools.[ES] La detección selectiva y sensible de variaciones de nucleótido único es fundamental para el diagnóstico precoz, la terapia individualizada y el pronóstico de enfermedades. La pandemia SARS-CoV-2 ha puesto de manifiesto la necesidad acuciante de desarrollar métodos de detección fiables, rápidos y sencillos para el diagnóstico masivo. Asimismo, existe una demanda creciente de biosensores genómicos que sean selectivos, multianalito y de bajo coste y permitan detectar e identificar ciertos biomarcadores oncológicos.La presente tesis doctoral se ha centrado en el desarrollo de sistemas integrados de amplificación isoterma, hibridación selectiva y biosensado óptico para la detección de mutaciones puntuales en los genes PIK3CA, KRAS y BRAF asociadas al cáncer colorrectal. Estos biomarcadores predictivos se relacionan con un incremento de la proliferación celular, apoptosis y resistencia a tratamientos con anticuerpos monoclonales (Cetuximab y Panitumumab). En este contexto, se han explorado los métodos isotermos de amplificación de ADN, dado que son particularmente adecuados para el desarrollo de una nueva generación de dispositivos de diagnóstico dirigidos a apoyar la medicina de precisión. En concreto, se ha seleccionado la amplificación isoterma por recombinasa-polimerasa (RPA) como una alternativa a los métodos de detección que requieren de infraestructuras singulares. Además, se ha investigado su integración con plataformas bioanalíticas, lo que supone un gran avance para la simplificación de los procesos de biorreconocimiento y su detección óptica. Esta metodología ha presentado ventajas frente a otros sistemas de detección de ADN, en términos de portabilidad y equipos, así como reducción de tiempos de ensayo y la posibilidad de realizar las pruebas de diagnóstico fuera del laboratorio. La presente tesis doctoral, enmarcada en este contexto, se estructura en 4 capítulos: En el capítulo 1 se presenta una nueva variante de la amplificación por recombinasa-polimerasa, denominada RPA-bloqueada, basado en el enriquecimiento de alelos minoritarios mediante de la introducción de un agente bloqueante. Además, en esta investigación se ha desarrollado un soporte analítico formado por un chip de policarbonato con sondas alelo-específicas ancladas covalentemente.La integración del método ha permitido desarrollar un sistema portátil para el genotipado simultáneo de mutaciones en los exones 9 y 20 del gen PIK3CA en líneas celulares y en tejidos tumorales de pacientes oncológicos. En el capítulo 2, se describe el desarrollo de un genosensor que incorpora partículas magnéticas conjugadas a sondas alelo-específicas para la concentración y detección del producto de amplificación selectivo derivado de la RPA-bloqueada. Con este genosensor, se han reducido los tiempos de hibridación y los volúmenes de reacción. Esta aproximación se ha concretado en un sistema portátil y de bajo coste para el genotipado del gen KRAS aplicable a muestras de tumores sólidos. Los capítulos 3 y 4 se centran en el desarrollo de superficies termoplásticas para el anclaje covalente de sondas alelo-específicas mediado por moléculas dendriméricas, con el objetivo de incrementar la densidad de inmovilización. Así, se ha estudiado el anclaje covalente a superficies termoplásticas de policarbonato y cicloolefina activadas, de sondas alelo-específicas, mediado por dendrímeros carboxílicos mediante la química de la carbodiimida y por dendrones mediante la reacción quimioselectiva del grupo tiol-ino. Dichos genosensores multiplexados han permitido el genotipado del codón V600 del gen BRAF y el codón H1047 del gen PIK3CA, en muestras de tejido biopsiado. Las investigaciones desarrolladas en la presente tesis han dado lugar a nuevas aportaciones metodológicas de interés basadas en la obtención de sistemas biosensores integrados. Estas plataformas, contribuirán al desarrollo de herramientas de diag[CAT] La detecció selectiva i sensible de variacions de nucleòtid únic és fonamental per al diagnòstic precoç, la teràpia individualitzada i el pronòstic de malalties. La pandèmia SARS-CoV-2 ha posat de manifest la necessitat apressant de desenvolupar mètodes de detecció fiables, ràpids i senzills per al diagnòstic massiu. Així mateix, existeix una demanda creixent de biosensors genòmics que siguen selectius, multianàlit i de baix cost i permeten detectar i identificar uns certs biomarcadors oncológics. La present tesi doctoral s'ha centrat en el desenvolupament de sistemes integrats d'amplificació isoterma, hibridació selectiva i biosensat òptic per a la detecció de mutacions puntuals en els gens PIK3CA, KRAS i BRAF associades al càncer colorectal. Aquests biomarcadors predictius es relacionen amb un increment de la proliferació cel·lular, apoptosi i resistència a tractaments amb anticossos monoclonals (Cetuximab i Panitumumab). S'han explorat els mètodes isoterms d'amplificació d'ADN, atés que són particularment adequats per al desenvolupament d'una nova generació de dispositius de diagnòstic dirigits a donar suport a la medicina de precisió. En concret, s'ha seleccionat l'amplificació isoterma per recombinasa-polimerasa (RPA) com una alternativa als mètodes de detecció que requereixen d'infraestructures singulars. A més, s'ha investigat la seua integració amb plataformes bioanalítiques, la qual cosa suposa un gran avanç per a la simplificació dels processos de biorreconeiximent i la seua detecció òptica. Aquesta metodologia ha presentat avantatges enfront d'altres sistemes de detecció d'ADN, en termes de portabilitat i equips, així com reducció de temps d'assaig i la possibilitat de realitzar les proves de diagnòstic fora del laboratori. La present tesi doctoral, emmarcada en aquest context, s'estructura en 4 capítols: En el capítol 1 es presenta una nova variant de l'amplificació per recombinasa-polimerasa, denominada RPA-bloquejada, basat en l'enriquiment d'al·lels minoritaris mitjançant de la introducció d'un agent bloquejant. A més, en aquesta investigació s'ha desenvolupat un suport analític format per un xip de policarbonat amb sondes al·lel-específiques ancorades covalentemente.la integració del mètode ha permés desenvolupar un sistema portàtil per al genotipat simultani de mutacions en els exons 9 i 20 del gen PIK3CA en línies cel·lulars i en teixits tumorals de pacients oncològics. En el capítol 2, es descriu el desenvolupament d'un genosensor que incorpora partícules magnètiques conjugades a sondes al·lel-específiques per a la concentració i detecció del producte d'amplificació selectiu derivat de la RPA-bloquejada. Amb aquest genosensor, s'han reduït els temps d'hibridació i els volums de reacció. Aquesta aproximació s'ha concretat en un sistema portàtil i de baix cost per al genotipat del gen KRAS aplicable a mostres de tumors sòlids. Els capítols 3 i 4 se centren en el desenvolupament de superfícies termoplàstiques per a l'ancoratge covalent de sondes al·lel-específiques mediat per molècules dendrimériques, amb l'objectiu d'incrementar la densitat d'immobilització. Així, s'ha estudiat l'ancoratge covalent a superfícies termoplàstiques de policarbonat i cicloolefina activades, de sondes al·lel-específiques, mediat per dendrimers carboxílics mitjançant la química de la carbodiimida i per dendrones mitjançant la reacció quimioselectiva del grup tiol-ino. Dits genosensors multiplexats han permés el genotipat del codó V600 del gen BRAF i el codó H1047 del gen PIK3CA, en mostres de teixit biopsiat Les investigacions desenvolupades en la present tesi han donat lloc a noves aportacions metodològiques d'interés basades en l'obtenció de sistemes biosensors integrats. Aquestes plataformes, contribuiran al desenvolupament d'eines de diagnòstic massiu.Martorell Tejedor, S. (2021). Desarrollo de métodos integrados para la determinación de biomarcadores genéticos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/176006TESISCompendi

Biosensores electroquímicos de ADN para la detección del Virus del Papiloma humano (VPH) basados en las metodologías: “Frecuencia característica” y “Corriente de relajación”

The present thesis reports the development of two electrochemical methods for HPV-16 sensing by using a DNA modified gold electrode which is based on potential and current relaxation measurement of the electrode composed double layer. The methods used allowed us to propose an equivalent circuit of DNA/Au electrode which was corroborated by electrochemical impedance spectroscopy (EIS) measurements. The increase in the potential relaxation and charge transfer resistance were used for sensing the DNA hybridization, using Fe(CN)64-/Fe(CN)63 as an electrochemical indicator. In order to determinate the potential and current relaxation of the composed double layer, the faradic and double layer current contributions were separated by using a rectifier diode arrangement. The target HPV-16 DNA sequence was quantified in a concentration interval from 1nM to 1000nM, a detection limit of 0.3nM was obtained. The biosensor shown an effective discrimination between a single-base mismatched sequence and the fully complementary HPV-16 DNA target.La presente tesis reporta el desarrollo de sensores para la detección de VPH-16 fundamentados en dos métodos electroquímicos, los cuales se basan en la medición del potencial y la corriente de relajación de la doble capa en electrodos de Au modificados con ADN. Los métodos utilizados permitieron proponer un circuito equivalente del electrodo Au/ADN el cual fue corroborado con mediciones hechas por espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) en los mismos electrodos. El aumento en el potencial de la relajación y la resistencia de transferencia de carga se utilizó para detectar la hibridación de ADN, usando el par Fe(CN)64-/Fe(CN)63 como indicador electroquímico redox. Con el fin de determinar el potencial y la corriente de relajación en la doble capa, las contribuciones faradaicas y no- faradaicas a la corriente fueron separadas mediante el uso de un diodo rectificador. La secuencia de ADN blanco del HPV-16 se detectó en un intervalo de concentración de 1 nM a 1000 nM, y fue obtenido un límite de detección de 0.3 nM. Los biosensores mostraron una discriminación efectiva entre una secuencia no complementaria (un solo mismatch) y el ADN totalmente complementario del VPH-16

Transductores de oro nanoestructurado para su empleo en el desarrollo de biosensores enzimáticos

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Química Física Aplicada. Fecha de lectura: 26-07-201

Desarrollo de técnicas inmunoenzimáticas con anticuerpos recombinantes y de técnicas de PCR en tiempo real para la detección de almendra y nuez de Brasil de alimentos

La detección de frutos secos alergénicos en distintos tipos de alimentos es primordial para garantizar la salud de los individuos sensibles, ya que la ingesta inadvertida de pequeñas cantidades de estos alérgenos podría provocarles reacciones adversas e incluso la muerte. Las técnicas analíticas para su detección se basan en el análisis de proteínas o del ADN, pero no se disponía de métodos adecuados para la detección de todos los frutos secos alergénicos de declaración obligatoria en la Unión Europea. El objetivo global de esta tesis doctoral ha consistido en el desarrollo de novedosas técnicas de ELISA con anticuerpos recombinantes y de PCR en tiempo real que permitieran la detección sensible y específica de nuez de Brasil y almendra en alimentos. Este trabajo ha sido pionero en la obtención de nuevas sondas de afinidad para la detección de frutos secos alergénicos. Utilizando la tecnología de phage display y las genotecas Tomlinson I y J se han obtenido fago-anticuerpos de tipo scFv específicos frente a la nuez de Brasil y la almendra, con los que se han desarrollado técnicas de ELISA indirecto para la detección de estos alérgenos en alimentos, con límites de detección de 5,0 y 0,1 mg por gramo, respectivamente. Utilizando una aproximación proteómica se han identificado las globulinas 11S de la nuez de Brasil y de la almendra como las proteínas diana reconocidas por los anticuerpos recombinantes obtenidos frente a estas especies. Además, el análisis de numerosos productos comerciales tales como productos de panadería y bollería, galletas, chocolates, barritas energéticas, helados, cremas para untar y bebidas, mediante las técnicas de ELISA desarrolladas ha permitido descubrir errores o fraudes de etiquetado y detectar almendra y nuez de Brasil en productos en los que no se advierte de su presencia. La obtención de anticuerpos recombinantes frente a varios frutos secos de declaración obligatoria supone un avance importante desde el punto de vista metodológico, puesto que estas nuevas sondas de afinidad no requieren la utilización de animales de experimentación y constituyen una fuente ilimitada de anticuerpos específicos. Finalmente, una vez obtenidos los anticuerpos recombinantes se consiguió modificar mediante ingeniería genética los fragmentos scFv específicos frente a almendra y expresarlos en un sistema eucariota con el fin de producir scFv biotinilados in vivo. La estrategia desarrollada para la biotinilación in vivo de proteínas recombinantes empleando la levadura Pichia pastoris es una de las aportaciones más novedosas de esta tesis. Tras su purificación y multimerización con un núcleo de avidina-peroxidasa, los scFv biotinilados y utilizados en una técnica de ELISA conservaron la capacidad de detectar proteína de almendra hasta 470 mg por kg. En cuanto al desarrollo de técnicas genéticas, en esta tesis doctoral se han desarrollado técnicas de PCR en tiempo real para la detección de nuez de Brasil y almendra, que se encuentran entre las más sensibles publicadas en la bibliografía, con niveles de detección en alimentos de 2,5 y 0,1 mg por kg respectivamente, por lo que tienen una gran utilidad práctica para el control de alérgenos y la verificación del etiquetado, tanto para las autoridades sanitarias como para las industrias alimentarias. Los cebadores y sondas desarrollados han permitido analizar un gran número de alimentos comerciales y poner de manifiesto la presencia de frutos secos alergénicos no declarados en un elevado porcentaje de muestras, que oscila entre un 10 por ciento en el caso de la nuez de Brasil y un 40 por ciento en el caso de la almendra. Puede concluirse que las técnicas desarrolladas en este trabajo proporcionan herramientas específicas, rápidas y sensibles para detectar la presencia de nuez de Brasil y almendra, contribuyendo al cumplimiento de la normativa europea en materia de etiquetado de los alimentos

Utilización de técnicas genéticas y anticuerpos recombinantes para la detección de alérgenos alimentarios de origen vegetal

El correcto etiquetado de los alimentos es un elemento fundamental para garantizar la seguridad alimentaria y prevenir los fraudes comerciales. En este marco, el Reglamento (CE) 178/2002 reconoce a los consumidores el derecho a estar debidamente informados respecto a los alimentos que adquieren para que puedan elegir con conocimiento de causa los productos adecuados a sus necesidades. Este hecho se hace especialmente relevante en el caso de personas que sufren algún tipo de alergia alimentaria dado que, en estos individuos, incluso pequeñas cantidades del alérgeno pueden desencadenar una reacción adversa severa. Para proteger a los consumidores alérgicos, el Reglamento (UE) 1169/2011 establece un total de 14 grupos de ingredientes que obligatoriamente deben declararse en el etiquetado de los productos que los contengan por ser los causantes de una elevada parte de las reacciones alérgicas humanas. Para dar cumplimiento a estas normativas, las industrias y agencias encargadas de la seguridad alimentaria deben disponer de técnicas analíticas sensibles y específicas para identificar aquellos alérgenos que puedan estar presentes, tanto de forma voluntaria como accidental, en los productos alimenticios..

Inmovilización de sondas de ADN para un genosensor piezoeléctrico de alta frecuencia

77 páginasEn la actualidad la detección y análisis del ADN han tenido un particular interés, no sólo por su gran importancia en investigación sino también por la gran cantidad de aplicaciones. En respuesta a la necesidad de nuevas tecnologías de detección rápidas y sencillas surgen los biosensores. Estos pueden clasificarse según su sistema de transducción o según el evento biológico que detecten. Específicamente se le denomina genosensor a aquel dispositivo con capacidad de detectar la hibridación entre cadenas complementarias de ADN. Un genosensor piezoeléctrico es un dispositivo con capacidad de detectar la hibridación de las cadenas complementarias de ADN detectando los cambios de masa utilizando un cristal piezoeléctrico. Los cristales piezoeléctricos dan lugar a las microbalanzas de cristal de cuarzo (QCM) y es sobre este sistema transductor donde se realiza la inmovilización del biorreceptor, proceso fundamental en el desarrollo de este tipo de dispositivos. En la actualidad es posible trabajar con microbalanzas de cristal cuarzo de alta frecuencia (HFF-QCM), las cuales presentan una mayor sensibilidad que las QCM convencionales. En el presente trabajo se inmovilizaron sondas de ADN de cadena sencilla para un genosensor piezoeléctrico de alta frecuencia; se comenzó por la conjugación química del ADN mediante la adición de un grupo amino en su extremo 5’ formando un enlace fosforamidita. Este proceso incluye una etapa posterior de separación por precipitación con alcoholes. La conjugación química se evaluó inmovilizando ADN sobre cristales de 10 y 100 MHz. Este proceso de inmovilización inició con la de formación de la SAM utilizando alcanotioles, con ácidos carboxílicos como grupo funcional, seguido por la activación de los mismos mediante solución de EDC y NHS. Para los dos tipos de cristales se inmovilizó en primer lugar una molécula modelo (BSA) seguido por la inmovilización de ADN. En los cristales de 10 MHz la inmovilización se caracterizó utilizando FTIR, y en los de 100 MHz se evaluó la respuesta del biosensor en tiempo real, incluyendo la variaciones en la concentración de ADN conjugado. Posteriormente se evaluó la hibridación entre las cadenas complementarias de ADN en diferentes buffer y temperaturas, utilizando espectroscopia UV. También se analizó la respuesta del biosensor ante la hibridación. Los resultados obtenidos mediante espectroscopia ultravioleta mostraron un porcentaje de recuperación del ADN cercano al 80% con un alto grado de pureza. Adicionalmente los espectros obtenidos de los cristales de 10 MHz evidenciaron la inmovilización BSA y ADN respectivamente. En los cristales de 100 MHz el proceso de inmovilización mostró una disminución en la fase para ambas biomoléculas, que confirma la formación del enlace covalente entre la SAM activada y el analito. El análisis en el biosensor permitió establecer que la concentración de ADN a inmovilizar es 1 µM. Adicionalmente, se concluyó que la condición a utilizar para la hibridación es el buffer TB a 25 °C. Finalmente, la inyección de la cadena de ADN complementaria mostró disminución en la fase, que indica que la hibridación se dio satisfactoriamente.Nowadays, DNA detection and analysis have sparked particular interest. Not just because of its great importance in investigation, but for its great range of applications: Biosensors have emerged as a response to the need for new detection technologies that are fast and easy. There are different types of biosensors that can be classified according to the system of transduction or to the biological event detected. Devices with the ability to detect hybridization within complementary strands of DNA are specifically designated as genesensors. A piezoelectric genosensor is defined as a device with the ability to detect the hybridization of the complementary strands of DNA. It detects changes in the mass using a piezoelectric crystal. These crystals prompt quartz crystal microbalances (QCM), and it is in this transducer system where the immobilization of the bioreceptor takes place, which is a fundamental process in the development of this type of devices. Recent advances have provided the necessary foundation to work with high frequency quartz crystal microbalances (HFF-QCM), which present a greater sensibility than conventional piezoelectric systems. In this investigation, single-stranded DNA probe test were immobilized for a high frequency piezoelectric genosensor (100 MHz). The process began with the chemical conjugation of DNA by adding an amino group to its 5’ end, and consequently forming a phosphoramidite bond. This process includes a subsequent phase of separation by precipitation with alcohols. The chemical conjugation was evaluated directly by immobilizing DNA on 10 and 100 MHz crystals. This immobilization process starts with the deformation of SAM using alkanethiols with carboxylic acids as functional group, followed by their activation with EDC and NHS solutions. For the two types of crystals it was first immobilized a model molecule (BSA) and then the DNA was immobilized. With the 10 MHz crystals, the immobilization was characterized with the use of FTIR, and with the 100 MHz crystals the response of the biosensor was evaluated in real time, including the variations in the conjugated DNA concentration. In the second phase the hybridation between the complementary strands of DNA was evaluated in different buffers and temperatures using UV spectroscopy. The response of the biosensor to hybridation was also analyzed. The results obtained through UV spectroscopy showed an approximate DNA recuperation percentage of 80 % with a high degree of purity. Additionally, the spectrums obtained from the 10MHz crystals exhibited the BSA and DNA immobilization respectively. In the 100MHz crystals, the immobilization process showed a decrease in the phase for both biomolecules; this confirms the formation of a covalent bond between activated SAM and the analyte. The analysis in the biosensor enabled to establish that the DNA concentration to immobilize is 1 µM. In addition, it was concluded that the condition to be implemented is buffer TB to 25 °C. To conclude, the injection of the complementary DNA strand showed decrease in the phase, which indicates that the hybridization process was satisfactory.Trabajo de grado RESTRINGIDO, desde: 25-11-2016 - hasta: 25-11-201